3.10. Пренатальная диагностика МВ. Организация пренатальной диагностики МВ в России

Особого внимания заслуживает пренатальная диагностика (ПД) МВ в семьях высокого риска. Отличительной чертой молекулярной диагностики является ее универсальность. Это означает, что диагностика может проводиться на любой стадии онтогенеза, в том числе до рождения, и материалом для ДНК-анализа могут быть любые клетки и ткани плода.

Благодаря успехам медицины зародыш человека доступен для исследований, а значит, и для диагностики практически на любой стадии развития. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, инструментальной и методической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией акушера-оператора. Для забора плодного материала обычно используют один из трех основных методов. К таковым относятся трансабдоминальная аспирация ворсин хориона/плаценты, амниоцентез или кордоцентез. Образцы ДНК выделяют из биоптатов хориона (плаценты), клеток амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови плода. При необходимости для молекулярного анализа можно использовать соскоб клеток с цитологических препаратов, ранее использованных для кариотипирования зародыша. Принимая во внимание высокую точность методов молекулярной диагностики, их большую чувствительность, необходимо помнить, что ее эффективность в значительной мере предопределена соблюдением следующих основных правил:

1. Необходимость точного клинического диагноза у пробанда

Отсутствие точного клинического диагноза «МВ» у пробанда делает применение молекулярно-генетических методов при ПД некорректным (учитывая, что при невыявленных патологических мутациях у пробанда предполагается проводить косвенную пренатальную ДНК-диагностику по сцепленным ДНК-маркерам). К сожалению, несовершенство лабораторных методов, недостаточный опыт клиницистов и медицинских генетиков, консультирующих семьи высокого риска, нередко ведут к тому, что на инвазивную ПД направляются женщины, не относящиеся к группе высокого риска по этому заболеванию.

2. Своевременное обследование молекулярными методами больного и семьи высокого риска

Идентификация мутаций в гене CFTR в каждой семье – необходимое условие успешной ПД. Особенно важно, чтобы идентификация мутаций и молекулярное маркирование мутантных хромосом были проведены еще при жизни больного и ДНК-обследование каждой семьи высокого риска осуществлено до наступления следующей беременности. Своевременное направление семей или образцов крови семей высокого риска до наступления следующей беременности в центры ДНК-диагностики для идентификации мутаций и выяснения информативности семьи является одним из необходимых условий успешного проведения ПД.

3. Выбор оптимального срока ПД

Решающим преимуществом молекулярной диагностики является возможность использовать для анализа любые ДНК-содержащие клетки организма или ткани. Анализ может быть проведен на любой стадии онтогенеза, начиная со стадии зиготы. На сегодняшний день можно диагностировать МВ в доимплантационном периоде. Материалом для диагностики являются полярные тельца зиготы или отдельные бластомеры дробящейся яйцеклетки, полученные микрохирургическим путем от доимплантационных зародышей – продуктов экстракорпорального оплодотворения.

Исходя из интересов женщины, оптимальным периодом для ПД молекулярными методами считается I триместр (10-12-я неделя). Это, однако, требует детального ДНК-анализа семьи еще до наступления беременности. Нередко ДНК-диагностику проводят и во II триместре, особенно в частично информативных семьях, когда необходимо дополнить ДНК-диагностику соответствующими биохимическими исследованиями.

4. Получение не загрязненного материнскими тканями материала плода

В ПД молекулярными методами важно предотвратить контаминацию плодного образца материнскими клетками. Учитывая крайне высокую чувствительность метода ПЦР, избежать загрязнения образцов плодных тканей материнскими клетками можно только путем тщательного отбора ворсинок хориона или плаценты под бинокулярной лупой с последующим отмыванием физиологическим раствором. Особенно важно не допустить попадания материнской крови при заборе пуповинной крови плода путем кордоцентеза. Высокий уровень акушера-оператора и использование качественных реакций на выявление примеси материнской крови позволяют избежать этого осложнения [49].

5. Четкость рекомендаций после ПД

Исходом пренатальной ДНК-диагностики может быть подтверждение диагноза «МВ» у плода или его исключение (с максимальной вероятностью 99,9%). В последнем случае плод может быть гетерозиготным носителем или не иметь мутантного аллеля гена CFTR.

В любом случае женщина (семья) должна быть в максимально сжатые сроки осведомлена о результатах диагностики и, соответственно, о вероятности рождения больного гетерозиготного носителя или полностью здорового ребенка.

Окончательное решение о сохранении или прерывании беременности всегда остается прерогативой самой пациентки. При прерывании беременности настоятельно рекомендуется верификация диагноза молекулярными или другими доступными методами.

Нередко ПД молекулярными методами оказывается затруднена в семьях высокого риска, в которых больной МВ ребенок уже умер, а мутации гена CFTR не удалось идентифицировать. В таких семьях возможна ПД заболевания биохимическим методом.

Характерные изменения в спектре белков амниотической жидкости плодов с МВ выявляются в течение короткого периода (с 16-й по 20-ю неделю беременности) и являются результатом нарушения проходимости кишечника плода вследствие транзиторного или персистирующего илеуса.

Пренатальная диагностика муковисцидоза в России проводится в ФГБНУ «МГНЦ» (Москва), НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и в ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва).

Алгоритм и точность молекулярной ПД, возможные источники ошибок

В ПД молекулярными методами важно учитывать два основных источника ошибок: 1) контаминацию плодного образца материнскими клетками (о которой сказано выше) и 2) возможность кроссинговера при использовании непрямого (косвенного) метода диагностики.

Опыт ПД МВ в России доказывает целесообразность применения как молекулярных, так и биохимических методов ПД.

Разработан оптимальный алгоритм ПД МВ в семьях высокого риска. Согласно данному алгоритму, в каждой семье проводятся молекулярные исследования для определения информативности, т.е. пригодности семьи для молекулярной диагностики.

На 1-м этапе отрабатываются варианты наиболее простой и надежной прямой молекулярной диагностики (идентификация мутаций). Достоверность молекулярной диагностики МВ прямым методом, т.е. путем идентификации мутаций в самом гене CFTR, очень высока и приближается к абсолютной. Несмотря на такую точность, учитывая все многообразие возможных изменений в геноме при созревании гамет (кроссинговер) и на начальных стадиях эмбриогенеза (мутагенный эффект), более оправданной является точность ответа около 99,9%.

На 2-м этапе (при наличии больного ребенка и отсутствии идентифицируемых мутаций) тестируются варианты косвенной диагностики (анализ внутригенных ДНК-маркеров: IVS1CA, IVS6aGATT, IVS8CA, IVS17bCA, IVS17bTA и сцепленных с геном CFTR ДНК-маркеров: XV-2c, KM19, CS7, J3.11, W30). Следует учитывать, что при использовании внегенных полиморфных сайтов вероятность ошибки диагностики будет прямо пропорциональна их расстоянию (и, соответственно, частоте кроссинговера) от гена CFTR. Точность непрямой диагностики достаточно высока, т.к. величина внутригенного кроссинговера, как правило, не превышает 0,1%, а частота кроссинговера между локусом гена CFTR и локусами используемых внегенных ДНК-маркеров – менее 1%. Принципиально важно проанализировать в семье высокого риска достаточное количество полиморфных сайтов для точного определения, с каким конкретным аллелем наследуется мутантный ген. Оптимальным является подбор двух-трех информативных для семьи ДНК-маркеров. При использовании вне-генных маркеров предпочтительно анализировать маркеры, фланкирующие локус гена. Точность ответа при косвенной диагностике варьируется от 99 до 99,9% в зависимости от использованного ДНК-маркера.

И, наконец, на 3-м этапе (если семья полностью неинформативна для ДНК-диагностики) проводится биохимическая диагностика по активности ферментов – двух пептидаз (гамма-глутамилтранспептидазы и аминопептидазы), а также кишечной формы щелочной фосфатазы в амниотической жидкости. В РФ применяется в Санкт-Петербурге.

Все вышесказанное позволяет утверждать, что проблема ПД МВ в России решена, разработана оптимальная стратегия проведения ПД с применением комплексного подхода и всего спектра молекулярных и биохимических методов, позволяющих провести диагностику на любой стадии внутриутробного развития [38, 49, 50]. Однако требуется информационная и разъяснительная работа с семьями больных для определения носителей мутаций и их своевременного обращения для проведения ПД.

3.11. Преимплантационная диагностика

Преимплантационная диагностика – новое направление медицинской генетики, возникшее в 90-х гг. XX века благодаря развитию вспомогательных репродуктивных технологий (экстракорпорального оплодотворения) и методов молекулярной цитогенетики и молекулярной генетики для анализа генома единичных клеток. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), в том числе и МВ, может стать предпочтительным выбором при планировании семьи для пар, стремящихся избежать повторного рождения ребенка, пораженного наследственной патологией.

В настоящее время наиболее часто используемый подход для ПГД включает биопсию одного бластомера у трехдневного эмбриона, находящегося на стадии 6-10 клеток, полученного методом ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида). Бластомеры анализируют, и здоровые эмбрионы переносят в матку. Такой подход к диагностике снимает проблему медицинского прерывания беременности, возникающую при обнаружении поражения плода, выявленного при проведении ПД в I или II триместре беременности. Но процедура, проводимая на столь ранних сроках развития, может быть травматична для эмбриона, снижая его жизненный потенциал. Поэтому наблюдается тенденция к проведению биопсии трофэктодермы на стадии 5-6-дневной бластоцисты. Однако проведение биопсии бластоцисты – более сложная процедура, чем биопсия бластомера, и к настоящему времени немногие центры изменили свой протокол [51].

По данным Европейского совета по репродукции и эмбриологии человека (ESHRE), МВ – одно из наиболее частых показаний для проведения ПГД в мире, оно составляет почти 10% от всех показаний для моногенных заболеваний [51]. Наилучшие практические методические рекомендации для ПГД, включающие описание инфраструктуры, оборудования, материалов, молекулярных процедур, установлены и обновляются Консорциумом ESHRE [52]. В России ПГД сосредоточена в нескольких центрах вспомогательных репродуктивных технологий в Москве и Санкт-Петербурге [50].

Приложения

1. Критерии направления пациентов на молекулярно-генетическое тестирование:

• Новорожденные с положительным ИРТ и положительными или пограничными значениями потовой пробы, мекониевым илеусом.

• Люди с пограничными значениями потовой пробы (см. Раздел «Диагностика муковисцидоза». (Потовая проба»)).

• Пациенты с клиническими проявлениями классического или моносимптомного МВ.

• CFTR-связанные заболевания (панкреатит, бесплодие у мужчин).

• Родственники больных МВ (для определения статуса носительства по желанию).

• Мать больного МВ (до беременности или во время беременности при наличии больного в семье);

• Плод на 10-12-й неделе при подозрении на МВ (при наличии больного МВ сибса) или обнаружении гиперэхогенного кишечника при УЗ-обследовании).

• Доноры для программ ЭКО.

2. Стандарты проведения молекулярно-генетических исследований при муковисцидозе

Требования к лаборатории, проводящей анализы на мутации гена CFTR [2, 14]:

• Лаборатория должна быть способна к выполнению тестирования ДНК с использованием высушенных проб крови, цельной крови (с ЭДТА) и мазков буккального эпителия.

• Анализ проб должен проводиться не реже 1 раза в неделю во избежание значительной задержки обработки.

• Медицинское учреждение, где расположена лаборатория, должно иметь лицензию по специальности «клиническая лабораторная диагностика».

• В региональной лаборатории в качестве стартового исследования следует применять панель для анализа ограниченного числа мутаций в гене CFTR, с помощью которой возможно распознать не менее 1 аномального аллеля у более чем 90% пациентов с МВ в локальной популяции.

• Если распознана лишь одна мутация, расширенный анализ ДНК (секвенирование гена и другие методы) должен быть доступен в региональной лаборатории или других лицензированных лабораториях, имеющих опыт диагностики МВ.

• Клиническую значимость обнаруженных генетических вариантов следует устанавливать с учетом рекомендаций настоящего Консенсуса.

3. Список требований к диагностическим панелям и методам, с помощью которых проводится молекулярно-генетическое тестирование CFTR

В качестве стартового исследования следует применять панель для анализа ограниченного числа мутаций в гене CFTR, с помощью которой возможно распознать не менее одного аномального алле-ля у более чем 90% пациентов с МВ в локальной популяции [2, 16].

Десять наиболее частых мутаций у российских больных, по данным МВ-регистра 2014 года, составляют 71,08% от всех мутантных аллелей, что также обеспечивает идентификацию по крайней мере, одного мутантного аллеля не менее чем у 90% пациентов с МВ (91%) в общей российской выборке.

4. Бланк генетического заключения

Комитетом по контролю качества ESHG (The European Society of Human Genetics – Европейское общество генетики человека) Quality committee [53] разработаны рекомендации по оформлению заключений диагностических генетических тестов.