4. Микробиология и эпидемиология хронической респираторной инфекции при муковисцидозе

Введение

Хроническая инфекция нижних дыхательных путей (НДП) – ключевой признак у больных муковисцидозом (МВ). Она является ведущим фактором, определяющим тяжесть клинического течения и прогноз заболевания. При изучении микрофлоры НДП в различных возрастных группах детей, больных МВ, исследователями разных стран установлено, что основными возбудителями инфекции легких у больных МВ являются Р. aeruginosa, S. aureus и H. influenzae. Показано [1, 2], что в первые годы жизни у больных МВ доминирует золотистый стафилококк, а затем основным возбудителем становится синегнойная палочка. При анализе данных микробиологических исследований установлено, что условно-патогенные микроорганизмы выделяются у 61,9% детей в возрасте до 1 года, у 92,9% – в возрасте 1-4 лет, у 93,8% – в возрасте 5-7 лет и в возрасте 8-18 лет – у 100% детей. Это свидетельствует о том, что колонизация легких больных МВ микроорганизмами начинается фактически с первых дней после рождения и достигает максимума уже к 5 годам жизни. При этом если в группе детей до 1 года S. aureus выявляется только у 28,6%, а P. aeruginosa – у 19%, то в возрасте 5-7 лет золотистый стафилококк обнаружен у 87,5%, а P. aeruginosa – у 31,2%. Таким образом, в возрасте до 1 года более чем у 1/3 больных МВ НДП еще не обсеменены микроорганизмами, в возрасте 1-4 лет НДП обсеменены почти у всех больных (92,9%), а к 8-18 годам – у 100% больных. Хроническая стафилококковая, синегнойная или смешанная инфекция начинает диагностироваться у 25% детей уже в возрасте 1-4 лет, в возрасте 5-7 лет – у 50% больных, в возрасте 8-14 лет – у 65% и к 18 годам – у 80% больных МВ [3, 4].

В последнее десятилетие очевидную клиническую значимость приобретают недостаточно изученные микроорганизмы – неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФМО) – Вurkholderia cepacia complex (Bcc), Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter ruhlandii, нетуберкулезные микобактерии, грибы рода Aspergillus. При этом каждый патоген способен вызвать воспаление, которое может в той или иной степени привести к повреждению дыхательных путей, снижению легочной функции, ухудшению клинического статуса.

Согласно международным рекомендациям, о хронической инфекции, вызванной P. aeruginosa, может свидетельствовать идентификация патогена в течение двух и более раз за последние 6 месяцев. Аналогичными критериями можно руководствоваться при выявлении у больного в монокультуре S. aureus и Bcc, а также смешанной инфекции. С практической точки зрения приемлемыми являются и критерии, предложенные Lee et al. в 2003 г. [39], согласно которым обнаружение патогена более чем в 50% образцов мокроты или смывов в течение предшествующих 12 месяцев может трактоваться как хроническая инфекция.

Установлено, что в 2/3 случаев хроническая инфекция легких вызывается не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, причем у госпитализированных больных, в отличие от амбулаторных больных, эти ассоциации представлены, как правило, не двумя, а тремя и более видами микроорганизмов. За рубежом [8, 9] эти показатели в 2 раза ниже: в 35% исследуемых образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) выявляют рост двух микроорганизмов, и в 10% случаев ассоциации представлены тремя и более видами микроорганизмов. По данным российских авторов [3, 4], наиболее часто встречающейся ассоциацией является сочетание P. aeruginosa + S. aureus (18,2%), а также P. aeruginosa + Bcc (9,1%). В 18% случаев от больных в составе микробных ассоциаций выделяли одновременно P. aeruginosa мукоидного и немукоидного фенотипов. В составе ассоциаций кроме P. aeruginosa часто выделяли других представителей НФМО – [5, 6], что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов микроорганизмов к легочной ткани. Полученные данные послужили основанием для заключения, что у больных МВ характерным проявлением инфекционных осложнений является смешанная инфекция и что Bcc является типичным представителем госпитальной микрофлоры [3, 7].

Таким образом, при анализе микрофлоры больных МВ можно утверждать, что с увеличением возраста у больных формируются постоянные очаги хронической легочной инфекции, основными возбудителями которой являются P. aeruginosa и S. aureus.

Особенностью бактерий P. aeruginosa, S. aureus и Bcc, Achromobacter spp. является устойчивость ко многим антибиотикам.

4.1. Микробиологические свойства основных возбудителей хронической респираторной инфекции при муковисцидозе

Микроорганизмы, инфицирующие больного МВ, определяют лечение, качество жизни, перспективы для трансплантации и общую выживаемость. Точная и своевременная идентификация возбудителей инфекций дыхательных путей имеет существенное значение для обеспечения своевременного начала лечения соответствующими антибиотиками в целях элиминации бактериальных патогенов и организации надлежащего инфекционного контроля для профилактики распространения патогенных микроорганизмов среди больных МВ. Ниже приведены основные микробиологические характеристики доминирующих возбудителей хронической респираторной инфекции и представлен алгоритм ее микробиологической диагностики.

Staphylococcus aureus

В настоящее время род Staphylococcus, относящийся к семейству Micrococcus, включает 45 видов [8]. Вид S. aureus – золотистый стафилококк – является одним из значимых патогенов для пациентов с МВ. Он вызывает хроническую инфекцию легких, приобретаемую в обществе и во время лечения в госпитальных условиях [9].

Бактерии S. aureus представляют собой грамположительные неподвижные кокки, при микроскопии располагающиеся в виде характерных скоплений – гроздей. Стафилококки не образуют спор, но могут образовывать капсулы. У больных МВ могут выделяться 3 морфологических типа колоний – мукоидные, немукоидные и с SCV (small-colony varients)-фенотипом [9]. SCV-фенотип представляет собой мелкие, без гемолиза и пигмента, медленно растущие колонии на 5% кровяной и шоколадной плотных агаризованных средах.

Особое значение для больных МВ имеют метициллин-устойчивые стафилококки (MRSA), которые обладают устойчивостью ко многим антибиотикам. МRSA обнаруживаются во многих больницах большинства стран мира. MRSA распространяются от человека к человеку, обычно с рук медперсонала [23]. Однако могут встречаться и другие механизмы передачи, например воздушно-капельный. Некоторые штаммы являются чрезвычайно трансмиссибельными, распространяясь внутри палат, между палатами и из больницы в больницу [23].

Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы

Среди возбудителей хронической инфекции легких у больных МВ значимое место занимают НФМО, общими признаками которых являются природная устойчивость ко многим антибиотикам, высокая резистентность к дезинфектантам и распространение в больничных стационарах от больного к больному [10]. НФМО, наиболее часто вызывающие инфекции, принадлежат к нескольким родам и условно могут быть разделены на оксидазоположительные – роды Pseudomonas (кроме видов P. luteola и P. oryzihabitans), Burkholderia, Moraxella, Chryseobacterium – и оксидазоотрицательные – роды Stenotrophomonas, Acinetobacter, Bordetella (кроме B. pertussis, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii) [11-13].

Большинство из упомянутых выше родов и видов НФМО обладают высокой степенью фенотипического и генотипического родства с бактериями рода Pseudomonas, и многие из них еще в 90-х гг. прошлого века относились к данному роду. Все эти микроорганизмы могут быть выделены из окружающей среды, однако клинической значимостью характеризуются только отдельные виды некоторых родов.

Pseudomonas aeruginosa

Первоначальная классификация рода Pseudomonas, состоящего из пяти соответствующих rRNA-групп, подверглась радикальному пересмотру, закончившемуся изменением классификации многих видов рода Pseudomonas и объединением в отдельные роды. Эти роды включают Burkholderia, Stenotrophomonas, Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax и Brevundimonas. Род Pseudomonas (sensu stricto) включает соответствующую rRNA-группу 1 и объединяет 11 видов: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. veronii, P. monteilii, P. stutzeri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. luteola, P. oryzihabitans.

Псевдомонады являются аэробными неспорообразующими грамотрицательными палочками, которые могут быть прямыми или слегка изогнутыми. Они имеют от 1,5 до 5 мкм в длину и от 0,5 до 1,0 мкм в ширину и обладают строгим дыхательным метаболизмом с использованием кислорода как конечного акцептора электронов. Некоторые изоляты могут расти в анаэробных условиях с использованием нитратов или аргинина в качестве конечных акцепторов электронов. Псевдомонады подвижны благодаря присутствию одной или более полярных флагелл. Клинические изоляты являются оксидазоположительными (за исключением P. luteola, P. oryzihabitans) и каталазоположительными, а также растут на агаре МакКонки как лактозонегативные колонии [12].

Псевдомонады широко распространены в природе с преимущественным обитанием в окружающей среде, связанной с водой. Они обнаружены в воде, почве, на растениях, включая овощи и фрукты. Ввиду способности выживать в водной среде эти микроорганизмы, особенно P. aeruginosa, стали одной из основных проблем в качестве возбудителей госпитальных инфекций [12]. Бактерии P. aeruginosa являются ведущей причиной нозокомиальных инфекций дыхательного тракта. Особое значение имеют для больных МВ. Основную роль в патогенезе инфекции легких у больных МВ играют мукоидный фенотип P. aeruginosa и воспалительные реакции больного [1, 9, 14].

Бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc)

Бактерии Bcc – это группа грамотрицательных, неспоробразующих бактерий. В мазках, окрашенных по Граму, эти микроорганизмы представляют собой полиморфные прямые грамотрицательные палочки размером 0,5-1,0 х 1,5-5 мкм. После культивирования на 5% кровяном агаре при t = 30 °C в течение 48 ч бактерии Bcc образуют серые гладкие колонии с ровными краями размером 1-2 мм с резким характерным запахом гнили. При наличии пигмента колонии могут быть окрашены в желтый цвет различной интенсивности. Вокруг колоний могут образовываться зоны гемолиза. На средах Эндо и МакКонки колонии Bcc размером 1 мм окрашены в светло-розовый цвет (лактозонегативные).

В настоящее время вид B. cepacia sensu lato включает 20 близкородственных геномоваров.

Таблица 1. Представители Burkholderia cepacia complex

Все геномовары могут выделяться от больных МВ, однако преобладающим является геномовар III – B. cenocepacia, обнаруженный в 70% случаев инфекции, вызванной Bcc, в Англии, Бельгии, США, Канаде [15].

В России от больных МВ, а также при исследовании образцов от больных с пневмонией в отделениях интенсивной терапии различных клиник города Москвы также были выявлены бактерии Bcc, преимущественно принадлежащие к геномовару IIIA – B. cenocepacia [14, 16].

Клиническое значение бактерий Bcc и патогенез вызванной ими инфекции

О колонизации легких Bcc у больных МВ впервые сообщено в начале 1970-х гг. [38]. Приблизительно у 20% больных, колонизированных Bcc, возникал так называемый «сепация-синдром», характеризующийся некротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией, увеличением СОЭ и лейкоцитозом, который приводил к быстрому летальному исходу. Было высказано предположение, что появление Bcc является основной причиной неблагоприятного исхода у больных МВ. В настоящее время установлено, что Bcc представляет особую опасность для больных МВ. Хроническая микробная колонизация дыхательных путей ведет к развитию легочной инфекции – основной причины прогрессирования бронхолегочного процесса и смертности у больных МВ. Установлено, что особенностью инфекции при МВ является персистенция ассоциаций микроорганизмов в 59,4% случаев. Особенностью персистенции штаммов Bcc является тяжелое течение в виде смешанной инфекции в ассоциации с бактериями P. aeruginоsa. Бактерии Bcc, способные персистировать у больных МВ, характеризуются устойчивостью ко многим антибиотикам. Доказана длительная (до 1 года 5 мес) персистенция штаммов Bcc, выделенных от одного больного, с помощью мониторинга микрофлоры НДП. Штаммы Bcc, колонизируя НДП больных МВ, способны длительно персистировать и передаваться от пациента к пациенту [3, 17, 18].

Другие, более редко встречающиеся возбудители хронической респираторной инфекции –

Achromobacter xylosoxidans и Achromobacter ruhlandii

Род Achromobacter в настоящее время включает 15 видов и 7 генетических групп.

А. xylosoxidans, A. ruhlandii – оппортунистические патогены, оксидазо- и каталазоположительные грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы. Обладают природной резистентностью ко многим антибиотикам.

В последнее время хроническая инфекция, вызванная Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter ruhlandii, у больных МВ встречается часто. Согласно полученным данным, третьим по частоте встречаемости из НФМО является Achromobacter xylosoxidans. Он и Achromobacter ruhlandii при исследовании образцов от больных детей за 2012-2013 гг. выделялись в 9% случаев [14].

Род Acinetobacter

Номенклатура видов Acinetobacter находится в процессе развития. В настоящее время получили наименование 7 видов. Для рутинных клинических целей в номенклатуре достигнут компромисс, и организмы обозначаются как комплекс Acinetobacter calcoaceticus-baumannii. Большинство клинических лабораторий могут дифференцировать биовар anitratus от биовара lwofii на основе окисления глюкозы (anitratis) или неокисления последней (lwofii).

Подобно P. aeruginosa, бактерии рода Acinetobacter распространены в окружающей среде. У 25% здорового населения этим микроорганизмом колонизированы кожные покровы, а у 7% колонизирована глотка.

Виды Acinetobacter чаще всего вызывают внутрибольничную пневмонию. В больничном учреждении факторами риска для возникновения внутрибольничной пневмонии являются интубация, лечение антибиотиками, пребывание в палатах интенсивной терапии. Описан ряд инфекций, связанных с использованием медицинских приборов, например нозокомиальные менингиты. Чаще всего пневмонии как внутрибольничные инфекции возникали у больных раком и с травмами, а у ожоговых больных возникала раневая инфекция [10].

Stenotrophomonas maltophilia

Этот микроорганизм, ранее обозначавшийся как Pseudomonas maltophilia (до 1988 г.), позднее – Xanthomonas maltophilia (1995-1997 гг.), является распространенным комменсалом, легко выделяемым из воды, почвы и сточных вод. Значимость этого микроорганизма при выделении не всегда ясна и может зависеть от наличия факторов риска. Так, в одном исследовании, проведенном в общем госпитале в 1979 г., показано, что только 6 (4,6%) из 128 изолятов оказались клинически значимыми, то есть вызывали внутрибольничную инфекцию (ВБИ). С другой стороны, исследования в онкологическом центре показали, что ВБИ вызывали 114 (48%) из 237 изолятов. S. maltophilia наиболее часто связана с пневмонией, особенно у больных с МВ, но может также вызывать широкий круг других ВБИ. Наибольшее число инфекций встречается в больничных учреждениях, где факторы риска включают злокачественные опухоли, использование центральных венозных катетеров и лечение антибиотиками. В исследовании 91 случая бактериемий, вызванных S. maltophilia, у 78% больных были злокачественные опухоли, а источником инфекции был центральный венозный катетер. Показатель смертности от ВБИ в данном исследовании составил 38%.

Недавно описано несколько необычных проявлений инфекции, вызванной S. maltophilia. Так, в сообщении о 114 инфекциях из онкологического центра говорится, что у 17 больных наблюдали инфекции слизистой оболочки и кожных покровов и/или инфекции мягкой ткани, 6 имели метастатические целлюлиты, представлявшие собой кожные узлы с окружающими целлюлитами, и один – повреждение в виде гангренозной эктимы.

Каждый из рассматриваемых НФМО способен вызывать развитие хронической пневмонии у больных с МВ, исход которой, как правило, неблагоприятен для больного [10].

Микобактерии, не принадлежащие к виду Mycobacterium tuberculosis

В последние годы возросло количество случаев инфицирования больных МВ микобактериями, не относящимися к виду M. tuberculosis (Nontuberculous mycobacteria (NTM)). Из мокроты пациентов выделяли Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum [19]. Среди пациентов с муковисцидозом в США бактерии NTM идентифицировали в 12,5% случаев, причем наиболее часто выделяли Mycobacterium avium complex (MAC). На втором месте по частоте высева были Mycobacterium abscessus [20]. Особенностью культивирования микобактерий является длительный период роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, у больных МВ образцы мокроты контаминированы P. aeruginosa и другими микроорганизмами. Рекомендуется обрабатывать образцы мокроты от больных МВ для устранения контаминации перед посевом 0,25% N-ацетил-L-цистеином и 1% гидроксидом натрия (NALC-NaOH), а затем добавлять 5% oxalic acid (OXA). Особое значение для идентификации и типирования этих микроорганизмов имеют молекулярно-генетические методы (ПЦР, мультилокусное секвенирование, секвенирование генома). Для точной постановки диагноза необходимы выделение культуры микобактерий и дальнейшее генетическое типирование [21].

Анаэробные микроорганизмы

Использование анаэробных культуральных методик указывает на обнаружение в дыхательных путях больных МВ большого числа анаэробов [14, 22]. В исследовании Tunney и cоавт. анаэробные бактерии, прежде всего Prevotella, Veillonella, Propionibacterium и Actinomyces, были изолированы в 64% образцов мокроты у пациентов с МВ. Колонизация P. aeruginosa достоверно повышает вероятность присутствия анаэробов в мокроте. Сходные анаэробные штаммы были обнаружены в бронхоальвеолярной жидкости у детей с МВ. В двух исследованиях показано, что микроорганизмы из рода Prevotella особенно часто встречаются у больных МВ [22]. Более того, высказывается предположение об их провоспалительном действии, что подтверждается резким увеличением концентрации данных микроорганизмов в период обострения. Тем не менее точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным.