3. Генетика муковисцидоза. Молекулярно-генетическая диагностика при муковисцидозе*

Муковисцидоз (МВ) – частое моногенное заболевание, обусловленное мутациями гена CFTR (ABCC7). Ген CFTR содержит 27 экзонов и расположен в регионе 31.1 длинного плеча 7-й хромосомы (7q31.1). Значительные достижения в развитии методов и технологий молекулярно-генетического тестирования позволяют в большинстве случаев успешно осуществлять молекулярно-генетическую диагностику МВ. Наибольшую трудность в настоящий момент представляет оценка вклада в развитие заболевания редких и ранее не идентифицированных мутаций, а также определение связи генотип-фенотип и влияния генов-модификаторов на тяжесть заболевания.

3.1. Типы генетических мутаций

Выявленные в гене CFTR мутации по типам распределяются следующим образом: миссенс-мутации составляют 39,61%; мутации со сдвигом рамки считывания – 15,60%; мутации, нарушающие сайт сплайсинга, – 11,36%; нонсенс-мутации – 8,32%; делеции/инсерции без сдвига рамки считывания – 1,99%; промоторные мутации – 0,75%; обширные перестройки, охватывающие несколько экзонов, – 2,59%; вариантные последовательности (полиморфизмы) – 13,30%; изменения последовательности, клинические последствия которых не доказаны, – 6,38% всех аллелей [1]. Случаи мутаций de novo и однородительской дисомии хромосомы 7, несущей мутантный ген CFTR, единичны [2].

Связь мутаций в гене CFTR с клиническими проявлениями МВ

Все мутации в гене CFTR можно разделить на четыре группы (далее приведены примеры наиболее частых мутаций, относящихся к разным группам; названия мутаций представлены согласно традиционной номенклатуре):

• А. Мутации, приводящие к муковисцидозу: F508del, R553X, R1162X, 2184insA, 2184delA, CFTRdele2,3, 3120+1G>A, I507del, 1677delTA, G542X, G551D, W1282X, N1303K, 621+1G>T, 1717-1G>A, A455E, R560T, G85E, R344W, R347P, 711+1G>T, 711+3A>G (*), 1898+1G>A, S549N, 3849+10kbC>T, E822X, 1078T, 2789+5G>A, 3659delC, R117H-T5 (*), R117H-T7 (*), D1152H (*), L206W (*), TG13-T5 (*).

• Б. Мутации, приводящие к CFTR-связанными заболеваниям: R117H-T5 (*), R117H-T7 (*), TG13-T5 (*), TG12-T5 (*), D1152H (*), S977F, R297Q (*), L997F, M952I, D565G (*), G576A (*), TG11-T5 (**), R668C-G576A-D443Y, R74W-D1270N.

• В. Варианты нуклеотидной последовательности, не имеющие клинического значения: I148T, R75Q, 875+40A/G, M470V, E528E, T854T, P1290P, 2752-15G/C, I807M, I521F, F508C, I506V, TG11-T5 (**). В настоящее время считается, что мутации S1235R, I1027T, R31C, 7T, G576A, R668C, V754M, L997F, R1162L не приводят к муковисцидозу, но в некоторых случаях могут встречаться при CFTR-связанных заболеваниях. Соответствующие сведения включены в базу данных CFTR2 [CFTR2.org].

• Г. Варианты нуклеотидной последовательности с недоказанным или неясным клиническим проявлением (многие миссенс-мутации).

Наблюдается частичное перекрывание групп А и Б. Так, некоторые мутации, отмеченные значком (*), встречаются как у пациентов с МВ, имеющих сохранную функцию поджелудочной железы, так и у пациентов с CFTR-связанными моносимптомными болезнями. Например, у пациентов-носителей мутации D1152H и какой-либо мутации, приводящей к типичному МВ, наблюдается варьирование клинического проявления заболевания от двустороннего отсутствия семявыносящих канальцев до МВ с сохранной функцией поджелудочной железы, но с тяжелым поражением легких. На разнообразие клинических проявлений у больных с такими «пограничными» мутациями оказывают влияние различные факторы: прогрессирование заболевания с возрастом, окружающая среда, гены-модификаторы [2].

В зависимости от механизма, нарушающего функцию белка CFTR, мутации гена CFTR подразделяют на шесть классов [2, 3]:

• Класс I. Нарушение синтеза белка. Результатом мутаций этого класса является нарушение транскрипции мРНК. К нему относятся мутации с наиболее серьезными фенотипическими проявлениями в связи с тем, что они приводят либо к нарушению синтеза стабильного протеина, либо к продукции аномального укороченного протеина вследствие образования кодона терминации. К этому классу относят нонсенс-мутации, мутации сдвига рамки считывания вследствие делеций или инсерций и мутации, приводящие к альтернативному сплайсингу мРНК.

• Класс II. Нарушение созревания белка. Мутации класса II приводят к неправильному фолдингу молекулы белка и нарушению ее транспорта к апикальной мембране клетки. В результате происходит деградация молекул CFTR в эндоплазматическом ретикулуме и молекула белка не достигает апикальной мембраны. Самой распространенной мутацией этого типа является мутация F508del. Различные миссенс-мутации также приводят к нарушению фолдинга молекулы белка.

• Класс III. Нарушение регуляции хлорного канала. Мутации этого класса приводят к синтезу белка CFTR, который транспортируется к клеточной мембране, но не отвечает на стимуляцию цАМФ. Мутации класса III локализованы в нуклеотидсвязанных доменах и регуляторном домене белка CFTR.

• Класс IV. Нарушение проводимости хлорного канала. К этому классу в большей степени относятся миссенс-мутации, располагающиеся в мембраносвязанных доменах. Мутации класса IV приводят к изменению проводимости хлорного канала вследствие сокращения времени открытия ионного канала и, соответственно, снижения ионного потока.

• Класс V. Снижение количества функционального белка. К классу V относятся мутации, при которых продуцируется пониженное количество нормального транскрипта, или снижается уровень функционального белка, или понижен уровень транспорта молекул белка CFTR. Мутации этого класса нарушают механизм сплайсинга, и транскрипты образуются в результате как аберрантного, так и нормального сплайсинга.

• Класс VI. Снижение времени нахождения белка на поверхности клетки. Класс VI включает мутации, приводящие к синтезу протеина с измененной стабильностью в результате потери 70-98 С-концевых аминокислотных остатков [4, 5, 6, 7].

Мутации I-III классов гораздо сильнее влияют на функцию белка CFTR, чем мутации IV или V классов, и ассоциированы с классическим МВ. Но следует отметить, что одна и та же мутация может вызывать более одного механизма нарушения функции CFTR-канала.

В настоящее время ряд исследователей выделяют VII класс мутаций. К классу VII относят мутации, в результате которых нарушено образование иРНК (информационной РНК). Это могут быть обширные перестройки гена CFTR (делеции, инсерции), охватывающие несколько экзонов и нарушающие нормальную структуру гена и нормальный сплайсинг (примером является распространенная в России делеция CFTRdele2,3), либо мутации, изменяющие донорный или акцепторный сайты сплайсинга одного экзона (например, 1717-1G>A) [8, 9]. Однако большинство специалистов считают нецелесообразным выделение этих мутаций из состава I класса.

3.2. Ассоциация генотипа и фенотипа

Значительное варьирование фенотипических проявлений МВ у больных может быть обусловлено действием большого числа факторов, включая разнообразие генотипов гена CFTR, влияние генов-модификаторов, факторов внешней среды, в том числе положительного и отрицательного эффектов от лечения [5, 10]. Достоверно известно, что сохранение функции поджелудочной железы является хорошим маркером остаточной активности хлорного канала CFTR [5, 10].

Мутации I, II и III классов, при которых белок CFTR практически полностью отсутствует на апикальной мембране либо его функция полностью нарушена, относятся к «тяжелым» и приводят к существенным нарушениям внешнесекреторной функции поджелудочной железы у больных. Мутации IV и V классов, при которых сохраняется остаточная функция хлорного канала, относятся к «мягким» [4, 11, 12].

Сочетание в генотипе двух «тяжелых» в отношении нарушения функции поджелудочной железы мутаций (например, F508del) в гомозиготном или компаундном состоянии приводит к панкреатической недостаточности, тогда как наличие одной «тяжелой» и одной «мягкой» или двух «мягких» мутаций чаще встречается у больных с сохранной остаточной функцией поджелудочной железы. «Мягкие» мутации доминируют над «тяжелыми» в отношении панкреатического фенотипа [4, 5, 10, 11]. К мутациям, при которых функция поджелудочной железы остается относительно сохранной, относят: 3849+10kbC>T, E92K, L138ins, R334W, 2789+5G>A, 3272-16T>A, 3849G>A, R347P, S1159P, S945L, S1159F, L1335P, R117H, 4428insGA, D1152H, 4382delA, Q98R, A141D, A120T, R1066H, 3272-26A>G, W19G, L864R, F1078I, Q1476X, P205S, P988R, K1468R, 1898+3A>G, 3272-11A>G, Y1032C, A455E, G178R, R352Q, R117C, 711+3A>G, D110H, D565G, G576A, L206W, V232D, D1270N, E831X. Пациенты-носители «мягких» мутаций с высокой вероятностью имеют лучший нутритивный статус, но и более высокий риск развития панкреатита, чем больные с двумя «тяжелыми» мутациями [2]. В ряде исследований было отмечено, что показатель смертности у больных, имеющих в генотипе две «тяжелые» мутации, значимо выше, чем у больных, имеющих хотя бы одну «мягкую» мутацию. Частично это связывают с большей степенью снижения функции легких и нутритивного статуса, более тяжелой степенью панкреатической недостаточности и более ранней колонизацией P. aeruginosa у больных, имеющих две «тяжелые» мутации. Предполагают, что генотип по гену CFTR может служить независимым фактором прогноза продолжительности жизни больного МВ [12, 13]. Однако, принимая во внимание широкую вариабельность тяжести поражения легких у больных МВ в течение жизни, следует учитывать, что со временем у больных с мутациями IV, V, VI классов функция легких может значительно снижаться. У взрослых пациентов с мутациями этих классов можно наблюдать тяжелое поражение легких, тогда как у некоторых больных с двумя мутациями I, II или III классов функция легких может оставаться относительно сохранной в течение длительного времени [2].

Следует иметь в виду, что разделение мутаций на «тяжелые» и «мягкие» является условным и используется в проведении научных исследований, в частности эпидемиологических. Использование же его для оценки клинического прогноза конкретного пациента является некорректным в силу ряда причин:

1. В гене CFTR обнаружено значительное количество мутаций, частота которых очень низка, что не позволяет проследить их ассоциацию c фенотипом.

2. Только часть известных мутаций строго ассоциирована с конкретными клиническими проявлениями.

3. Отдельные мутации могут характеризоваться вариабельностью клинических проявлений.

4. Пациенты, гомозиготные по отдельной мутации (такой, например, как F508del), обычно строго ассоциированной с определенной формой МВ, могут иметь менее выраженную степень проявления основных симптомов вследствие ранней диагностики и современной терапии по сравнению с пациентами, диагноз у которых был установлен до введения неонатального скрининга.

На основании имеющихся данных можно сделать следующие выводы:

• фенотип заболевания зависит как от генотипа по гену CFTR, так и от сопутствующих факторов (других генов, факторов окружающей среды);