2. Диагностика муковисцидоза

Критерии диагноза

Своевременная диагностика муковисцидоза, обеспечивающая в большинстве случаев раннее начало терапии, в том числе на доклиническом этапе, улучшает прогноз заболевания, повышает эффективность лечения, позволяет предупредить развитие тяжелых осложнений, значительного отставания в физическом развитии, а в ряде случаев и необратимых изменений в легких. Ранняя диагностика позволяет семье вовремя решить необходимые вопросы, связанные с рождением здорового ребенка (генетическое консультирование, пренатальная диагностика МВ в последующие беременности) [1].

Диагностика МВ включает в себя:

I) диагностику по неонатальному скринингу (до клинических проявлений или при их дебюте) [2];

II) диагностику при наличии клинических проявлений [1]:

• пациенты из различных групп риска, имеющие характерные клинические проявления (Табл. 2-4), не вошедшие в программу неонатального скрининга на МВ;

• пациенты с ложноотрицательными результатами неонатального скрининга с клиническими проявлениями заболевания;

• пациенты с неонатальной гипертрипсиногенемией, не получившие обследования в виде потовой пробы;

III) диагностику среди родственников больных;

IV) пренатальную диагностику;

V) преимплантационную диагностику.

Диагностические критерии МВ

Для решения проблем диагностики МВ, в том числе и его атипичных форм, были разработаны критерии, согласно которым обязательным для МВ является наличие характерного клинического синдрома плюс доказательство какого-либо нарушения функции хлорного канала [3].

Учитывая все научные достижения в понимании природы муковисцидоза и МВ-зависимых заболеваний за последние 10 лет [4, 5], в 2013 г. группа экспертов Европейского общества муковисцидоза (European Cystic Fibrosis Society) под руководством Carlo Castellani подготовила новые стандарты диагностики в редакции Alan R. Smyth и Scott Bell (https://www.ecfs.eu/ecfs-standards-care/introduction) (Cхема 1).

Схема 1. Диагностические критерии муковисцидоза ECFS, 2013 [6]

Положительная потовая проба

и/или

две патогенные мутации в гене CFTR в транс-положении⁶, вызывающие МВ (согласно базе CFTR-2, http://www.cftr2.org)

и

Неонатальная гипертрипсиногенемия

или

с рождения или появившиеся позже характерные клинические признаки, включая (но не ограничиваясь ими) такие, как диффузные бронхоэктазы, высев из мокроты значимой для МВ патогенной микрофлоры (особенно синегнойной палочки), экзокринная панкреатическая недостаточность, синдром потери солей, обструктивная азооспермия (мужчины)

I. Неонатальный скрининг

С июня 2006 г. в ряде регионов РФ, а с января 2007 г. во всех субъектах РФ в рамках Национального приоритетного проекта «Здоровье» проводится массовый скрининг новорожденных на пять наследственных заболеваний, включая муковисцидоз.

В основе большинства существующих схем скрининга лежит определение уровня иммунореактивного трипсиногена (ИРТ) в крови новорожденных на первой неделе жизни, что является высокочувствительным (90-95%), но неспецифичным признаком. В популяции неонатальная гипертрипсиногенемия обнаруживается у 5-10 детей из 1000 здоровых новорожденных. Повышение уровня иммунореактивного трипсиногена при МВ происходит в результате закупорки протоков панкреатических желез вязким секретом, что препятствует проникновению трипсиногена в просвет тонкого кишечника, где он в норме превращается в трипсин. Это приводит к выбросу трипсиногена в кровь [7].

Протокол скрининга в РФ включает 3 обязательных этапа: ИРТ, ретест ИРТ (чувствительность более 96%, специфичность – не менее 99,8%) [8], потовый тест (Схема 2). На первом этапе в крови новорожденных (4-5-й день – у доношенных, 7-8-й день – у недоношенных) определяется уровень ИРТ. Взятие образцов крови осуществляется в соответствии с Приказом МЗиСР от 22.03.2006 г. № 185 «О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания». Все требования к получению, хранению и отправке образцов крови должны строго соблюдаться. В образцах крови ИРТ нестабилен, в связи с чем не рекомендуется их хранение и транспортировка в течение более чем 14 дней. Недопустимо загрязнение сухих пятен крови фекалиями новорожденного, приводящее к ложноположительным результатам [9]. При превышении порогового уровня ИРТ проводится ретест на 21-28-й день жизни. Допускается оценка ИРТ в образцах, взятых не позднее 8 недель жизни, так как может происходить снижение его активности и теряется диагностическая ценность исследования [10, 11]. Как правило, в случае ложноположительных результатов к концу первого месяца первично повышенные показатели ИРТ снижаются, в отличие от показателей детей с муковисцидозом. Однако возможны исключения [12]. Если по какой-то причине первый образец крови для определения ИРТ берется после 21 дня, но до 8 недель, то за пороговый показатель принимается значение ретеста (40 нг/мл). Если образец крови взят после 8-й недели и показатель ИРТ превышает пороговый уровень, ребенок должен быть направлен в Центр муковисцидоза для проведения потовой пробы. В случае нормального показателя ИРТ, взятого после 8 недель, нельзя учитывать этот результат для исключения ребенка из группы риска. В этом случае должно быть указано, что неонатальный скрининг на муковисцидоз не проводился [13]. По желанию родителей такому ребенку необходимо провести потовую пробу.

Схема 2. Алгоритм неонатального скрининга на МВ в Российской Федерации

Потовая проба

Потовая проба является надежным методом диагностики МВ практически у 98% больных [14]. По-прежнему «золотым стандартом» считается определение хлоридов пота по Гибсону-Куку [15]. Во многих центрах в качестве потового теста используется определение проводимости пота с применением системы для сбора и анализа пота Macroduct в комплексе с потовым анализатором Sweat-Chek, а также системы Nanoduct фирмы Vescor (США), разработанной специально для обследования новорожденных. Определение концентрации хлоридов возможно из потовой жидкости, собранной с помощью системы для сбора и анализа пота Macroduct. Многочисленные зарубежные исследования, многолетний российский опыт демонстрируют хорошую корреляцию между определением проводимости и концентрацией хлоридов [16, 17, 18, 19, 20]. На практике оптимальным является сочетанное применение методик. Во всех сомнительных случаях при получении повторных пограничных результатов проводимости пота следует провести количественную пробу по Гибсону-Куку в лаборатории с достаточным опытом подобных исследований [6]. В случае недоступности метода определения хлоридов пота необходимо наряду с повторными определениями проводимости пота провести полное обследование пациента, включающее ДНК-диагностику, фекальную эластазу и др. Важно помнить, что проводимость пота определяется совокупностью всех ионов, присутствующих в потовой жидкости (калий, натрий, хлор, бикарбонат, аммоний и др.), и полученный результат превышает истинную концентрацию хлоридов [16, 17].

Потовая проба может быть проведена ребенку в возрасте 48 часов с весом не менее 2 кг [21-23]. У недоношенных детей скорость потоотделения, как правило, ниже, чем у доношенных. Время сбора пота не должно превышать 30 минут, минимально допустимое количество пота – 75 мг (15 мкл в коллекторе Macroduct), скорость потоотделения должна быть не менее 1 г/м²/мин [9]. Обязательным является предварительное тщательное очищение кожи пациента, включающее мытье мылом и последующую обработку спиртом без добавления хлора. Не допускается нанесение лосьонов и масел на кожу перед проведением пробы. Особого внимания требует подготовка кожи у пациентов, длительно находящихся в стационаре.

В качестве нормальных показателей рекомендуется учитывать уровни хлоридов (проба по Гибсону-Куку), не превышающие <30 ммоль/л, и показатели проводимости <50 ммоль/л. Положительными в отношении муковисцидоза являются уровень хлоридов >60 ммоль/л и проводимость пота >80 ммоль/л (Табл. 1) [9, 5, 17, 18, 23].

Таблица 1. Интерпретация результатов потового теста

Пограничные результаты потовой пробы

Возможные причины пограничных результатов потовой пробы:

1. Индивидуальные особенности у людей без муковисцидоза, особенно у взрослых.

2. Неправильная подготовка к пробе.

3. Носительство «мягких» мутаций при муковисцидозе.

Таким образом, пациенты с пограничными результатами потовых проб (хлориды 30–59 ммоль/л и/или проводимость 50-79 ммоль/л) представляют реальные трудности для диагностики.

Рекомендации:

• использование нескольких методов определения хлоридов пота; повторные исследования;

• расширенный ДНК-анализ (секвенирование гена);

• расширенное клинико-лабораторное и инструментальное обследования: копрология (в том числе определение фекальной эластазы), электролиты в биохимическом анализе крови, посев мокроты / мазок с задней стенки глотки, рентгенография грудной клетки, пазух носа, спермограмма;

• наблюдение в Центре муковисцидоза до окончательного принятия решения о диагнозе. Пациенты не снимаются с учета, пока диагноз не будет исключен;

• в ряде европейских центров для подтверждения дефекта ионного транспорта применяются метод определения разности назальных потенциалов или измерение электрического тока в биоптате кишки [23, 24, 25], отражающие нарушение функции хлорного канала. Оба метода основаны на электрическом характере транспорта ионов и являются высокоинформативными для диагностики МВ.

В настоящее время в РФ данные методы не используются.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты потового теста

При проведении потового теста возможно получение ложноположительных (до 15%) и ложноотрицательных (до 12%) результатов. Это может быть связано как с техническими ошибками, так и с физиологическими особенностями пациента [26].

Ложноотрицательные результаты потовый тест может дать у детей, больных МВ, с наличием без-белковых отеков, по ликвидации которых тест становится положительным. Необходимо помнить о возможности получения отрицательного результата потовой пробы у больных МВ, в частности у гомо- или гетерозиготных носителей некоторых мутаций CFTR, при которых частично сохраняется функция хлорного канала (например, 3849+10 kb C>T, Е92К) [27-29].

С другой стороны, ложноположительный тест можно получить у больных с целым рядом заболеваний. Однако большинство из этих состояний имеет весьма характерную клиническую картину и частота их в популяции невелика [30].

В Таблице 2 перечислены состояния, в ряде случаев сопровождающиеся повышением содержания хлоридов пота. Следует помнить, что подобные ситуации встречаются крайне редко, а положительная потовая проба является высокоспецифичным тестом для диагностики МВ.

Таблица 2. Другие состояния, при которых потовая проба может быть положительной и пограничной

• Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)

• Недостаточность функции надпочечников

• Псевдогипоальдостеронизм

• Адреногенитальный синдром

• Синдром Дауна

• Синдром Кляйнфельтера

• Атопический дерматит

• Эктодермальная дисплазия

• Семейный холестатический синдром

• Фукозидоз

• Гликогеноз, тип II

• Недостаточность глюкозо-6-фосфатазы

• Гипотиреоз

• Гипопаратиреоз

• Резко выраженная гипотрофия (кахексия)

• Нервная анорексия

• Синдром Мориака

• Мукополисахаридоз

• Нефрогенный несахарный диабет

• Хронический панкреатит

• Гипогаммаглобулинемия

• Целиакия

При получении положительного результата потовой пробы ее следует повторить во время следующего визита пациента.

Дети с мекониевым илеусом, внутриутробными признаками гиперэхогенного кишечника, имеющие больных муковисцидозом сибсов, а также относящиеся к группе высокого риска, должны быть обследованы путем проведения потового теста независимо от результатов скрининга [9].

Показания к проведению молекулярно-генетического тестирования в рамках неонатального скрининга:

• Положительный результат неонатального скрининга (неонатальная гипертрипсиногенемия) и положительная потовая проба

• Пограничные результаты потовой пробы

• Невозможность проведения потовой пробы (недостаточный вес, незрелость новорожденного, тяжесть состояния, др.)

• По желанию родителей при неонатальной гипертрипсиногенемии и отрицательном результате потовой пробы

Учитывая современные подходы к патогенетической терапии МВ, всем пациентам с МВ должно быть рекомендовано проведение генетического исследования (см. Раздел «Генетика муковисцидоза. Молекулярно-генетическая диагностика при муковисцидозе»).

Возможные результаты неонатального скрининга:

1. Неонатальная гипертрипсиногенемия и положительный результат потовой пробы. Диагноз МВ подтвержден. Необходимо наблюдение командой специалистов по муковисцидозу, оптимально – в Центре муковисцидоза.

2. Неонатальная гипертрипсиногенемия, повторные пограничные результаты потовой пробы, две мутации CFTR, клинически значимые, в транс-положении (см. Раздел «Генетика муковисцидоза. Молекулярно-генетическая диагностика при муковисцидозе»). Диагноз МВ подтвержден. Необходимо наблюдение командой специалистов по муковисцидозу, оптимально – в Центре муковисцидоза.

3. Неонатальная гипертрипсиногенемия, повторные пограничные результаты потовой пробы, одна или ноль мутаций CFTR, вызывающих МВ. Диагноз «МВ» исключить нельзя [28]. Обязательны консультация в Центре муковисцидоза, ежеквартальные осмотры пациента, при необходимости – чаще. Повторные потовые пробы как минимум в 6-12 мес., при необходимости – на втором году жизни. Секвенирование гена CFTR. Дополнительные методы обследования в полном объеме.

4. Неонатальная гипертрипсиногенемия, отрицательные результаты потовой пробы, две мутации CFTR (одна из которых – с недоказанным или неясным клиническим проявлением). Диагноз «МВ» исключить нельзя [31]. Обязательна консультация в Центре муковисцидоза. Осмотры и повторные потовые пробы в возрасте 6-12 мес, далее ежегодно или чаще, с оценкой основных клинических параметров (вес, рост, наличие респираторных проявлений). Национальный алгоритм неонатального скрининга не предполагает проведения ДНК-диагностики в случае отрицательного результата потовой пробы. Однако в редких случаях такая диагностическая последовательность возможна. Например, в случае невозможности проведения потовой пробы новорожденному с неонатальной гипертрипсиногенемией.

5. Неонатальная гипертрипсиногенемия, отрицательные результаты потовой пробы. Муковисцидоз маловероятен. Диагноз: неонатальная гипертрипсиногенемия. Наблюдение по месту жительства, повторная консультация с проведением повторной потовой пробы в возрасте 1 года или ранее при появлении симптомов заболевания.

Состояния, описанные в пунктах 3 и 4, соотносятся с «неопределенным диагнозом при положительном неонатальном скрининге на муковисцидоз» (CFSPID, CF Screen Positive, Inconclusive Diagnosis) в европейских рекомендациях по диагностике и CFTR-ассоциированным метаболическим синдромом (CRMS, CFTR-related metabolic syndrome) (Cystic Fibrosis Foundation, США) (см. Раздел «Классификация муковисцидоза») [31]. Они отражают сложности, периодически возникающие во всем мире, с интерпретацией результатов неонатального скрининга. Пациенты с неонатальной гипертрипсиногенемией и неустановленным диагнозом представляют собой группу риска по развитию МВ или CFTR-ассоциированных состояний, в связи с чем требуют наблюдения специалистами в течение неопределенного времени. Родители должны получить максимально исчерпывающую информацию о состоянии ребенка, симптомах заболевания, в том числе синдрома псевдо-Барттера, методах его профилактики.

Ложноположительные результаты скрининга

Наряду с МВ существует целый ряд патологических состояний, при которых могут иметь место гипертрипсиногенемия, а именно почечная недостаточность, внутриутробная инфекция, атрезия кишечника, несахарный почечный диабет, трисомия 13-й и 18-й пар хромосом. С определенной частотой повышение ИРТ отмечается у новорожденных североафриканского и афро-американского происхождения, а также у носителей мутаций в гене CFTR [32-33]. Минимальная положительная прогнозирующая величина (PPV-positive predictive value), т.е. число детей с истинно положительным результатом скрининга по отношению к общему числу положительных результатов, должна составлять 0,3 [6].

Ложноотрицательные результаты скрининга

Минимальная чувствительность программы скрининга (процент истинно положительных результатов скрининга от суммы истинно положительных и ложноотрицательных, т.е. пропущенных при скрининге) должна составлять 95% [6, 9].

Ложноотрицательные результаты теста на ИРТ, проведенного на первой неделе жизни, могут отмечаться:

• у новорожденных с мекониевым илеусом. Причины этого явления до конца непонятны, возможно, это связано с отсутствием энтерального питания или оперативным вмешательством. Причем позже у этих детей может отмечаться существенное повышение показателя;

• при переливании препаратов крови менее чем за 72 ч до взятия образца [13];

• при респираторных и кишечных вирусных инфекциях;

• у некоторых недоношенных или незрелых новорожденных.

Учитывая вероятность наличия неонатальной гипертрипсиногенемии у гетерозиготных носителей мутаций в гене CFTR, считаем необходимым информировать родителей ребенка с положительным скринингом на МВ и отрицательными результатами потовой пробы о возможности обследования на предмет носительства мутаций.

План наблюдения ребенка с муковисцидозом, выявленным по программе скрининга новорожденных

Оптимальные сроки постановки диагноза: не позднее 8 недель [35]. Ранняя диагностика способствует лучшему физическому развитию, снижает потребность в терапии, а также дает возможность замедлить прогрессирование патологических изменений в легких.