Глава 3
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

3.1. Метаболизм

Метаболизм представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и пластического (конструктивного) метаболизма (анаболизма).

Прокариоты, как и эукариоты, в процессе ферментативных катаболических реакций выделяют энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге строятся биополимеры – составные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и катаболизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

3.2. Источники углерода и типы биологического окисления

В соответствии с законом сохранения энергии все функции живого организма, требующие затраты энергии, должны осуществляться за счет внешних источников энергии, которые бывают двоякого рода.

Автотрофные организмы могут синтезировать органические соединения из неорганических веществ (прежде всего из СО₂ иН₂О), используя дополнительные источники энергии. Гетеротрофные организмы используют в качестве источника энергии готовые органические «питательные вещества» и живут за счет автотрофных организмов и их биосинтетических процессов.

При распаде органических веществ химически связанная энергия освобождается (катаболизм, диссимиляция). Этот распад без участия кислорода (анаэробные условия) приводит к образованию органических продуктов, богатых энергией, таких, как органические кислоты или этанол (брожение), а при использовании кислорода (аэробные условия) – конечных продуктов: углекислого газа и воды (дыхание), бедных энергией.

Суммарные уравнения дыхания складываются из двух процессов:

1) постепенного расщепления субстрата с отнятием водорода, который связывается с коферментами;

2) постепенного окисления водорода в результате переноса его на кислород.

Расщепление углеводов происходит в результате последовательного воздействия на субстрат различных ферментов. Этот процесс начинается с гликолиза. При подготовке к расщеплению различные углеводы превращаются в фруктозо-1,6-фосфат. Гликолиз – это процесс окислительного расщепления, происходящий в цитоплазме бактерий и ведущий от фруктозо-1,6-фосфата к промежуточному продукту – пировиноградной кислоте.

При разных видах брожения дальнейшая судьба продуктов гликолиза – пировиноградной кислоты и NAD ⋅ Н – различна.

При молочнокислом брожении (стрептококки, лактобациллы) водород переносится на пировиноградную кислоту и образуется молочная кислота:

При спиртовом брожении (сахаромицеты) пировиноградная кислота сначала декарбоксилируется, т. е. от нее отщепляется СО₂,азатем промежуточный продукт (ацетальдегид) восстанавливается в этиловый спирт (этанол) в результате переноса водорода:

При маслянокислом брожении (клостридии) пировиноградная кислота превращается в ацетат [C H ₃ −C=0], связанный с коферментом (ацетил-СоА). Два таких остатка соединяются в ацетоацетат, который восстанавливается до н-масляной кислоты (СН₃СН₂СН₂СООН).

В 30-е годы XX века В. А. Энгельгардом, О. Варбургом, Ф. Лимпаном и Д. Диккенсаном было доказано, что кроме гликолиза в бактериальных клетках существует еще один путь расщепления углеводов – ступенчатый окислительный распад гексоз до пентоз и других сахаров с более короткой цепью. Ключевую роль в таких реакциях играют пентозофосфаты, в связи с чем этот цикл называется пентозофосфатным.

Суммарное уравнение этого цикла имеет вид:

Небольшое число микроорганизмов, к которым относятся главным образом бактерии из рода Pseudomonas, получают энергию с помощью специфического метаболического пути – Энтнера – Дудорова. Существует предположение, что он появился в связи с высокой потребностью прокариот в пировиноградной кислоте как кратчайшему пути ее образования (всего 4 реакции, тогда как при гликолизе она образуется после 9 реакций).

В аэробных условиях пировиноградная кислота (ПВК) подвергается окислительному декарбоксилированию в цикле трикарбоновых кислот до конечных продуктов: СО₂ иН₂О. Непосредственным реакциям цикла предшествует подготовительная фаза – окисление пировиноградной кислоты до ацетилкоэнзима А (ацетил = СоА):

Окислительное декарбоксилирование ПВК катализируется пируватдегидрогеназной системой. Она состоит не менее чем из трех ферментов, которые используют пять коферментов: тиамидинфосфат, амид липоевой кислоты, коэнзим А, FAD, NAD.

При аэробном окислении 1 моля глюкозы клетка получает 38 молей АТФ, тогда как при гликолизе только два.

В цикле трикарбоновых кислот от субстратов отделяются протоны и электроны. Они поступают на коферменты NAD⁺ и FAD⁺, которые передают их в дыхательную цепь, образованную окислительно-восстановительными ферментами, находящимися на плазматической мембране у прокариот и на внутренней мембране митохондрий у эукариот. Передвигаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая порциями свою энергию. В последнем звене цепи они восстанавливают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе электронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных связях АТФ. Окислительно-восстановительные ферменты представлены дегидрогеназами, флавопротеидами, цитохромами, а также убихиноном и белками, содержащими железо и серу.

Автотрофный метаболизм осуществляется бактериями путем фотосинтеза и хемосинтеза. Для облигатных автотрофов фотосинтез – единственный источник энергии: у них нет процессов диссимиляции, поставляющих АТФ. Фотосинтез состоит из двух фаз: световой и темновой. Световой процесс можно представить так:

Во время темновой фазы атомы водорода, поставляемые световыми реакциями, используются для восстановления СО₂ до углеводов согласно общему уравнению фотосинтеза:

При этом на каждый моль синтезированного углевода запасается около 160 кДж энергии.

Русским микробиологом С. Н. Виноградским было показано, что хемосинтезирующие бактерии получают энергию при окислении неорганических соединений:

Хемосинтез (в отличие от фотосинтеза) – облигатно аэробный процесс.

При аэробном (кислородном) дыхании конечным акцептором электронов служит кислород, а при анаэробном (бескислородном) – неорганические соединения. Исходя из этого, по типу дыхания выделяют следующие группы бактерий:

– строгие (облигатные) аэробы, которые размножаются только в присутствии кислорода, например псевдомонады;

– микроаэрофилы, которым требуется меньшее количество кислорода, например кампилобактеры;

– факультативные анаэробы, которые могут размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях, например энтеробактерии;

– строгие (облигатные) анаэробы, которые размножаются только в бескислородных условиях, например бактероиды.

Отдельно следует выделить аэротолерантные бактерии, которые способны расти в присутствии кислорода, но они не используют этот кислород в качестве источника энергии, а получают энергию при брожении, например молочнокислые бактерии.

Токсическое действие кислорода на бактерии объясняется отсутствием у них ферментов каталаз и системы регуляции окислительно-восстановительного потенциала.

3.3. Источники азота

Для синтеза азотсодержащих соединений (аминокислот, пуринов, пиримидинов, некоторых витаминов) микроорганизмы нуждаются в доступном источнике азота. Одни из них способны усваивать молекулярный азот из атмосферы (азотфиксирующие бактерии), другие ассимилируют только азотсодержащие органические соединения.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония, называют прототрофами. В отличие от них микроорганизмы, не способные синтезировать какое-либо из жизненно необходимых соединений, называют ауксотрофами. Они ассимилируют эти и другие соединения в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина. Ауксотрофами чаще всего являются патогенные или условно-патогенные для человека микроорганизмы.

Кроме азота и углерода всем микроорганизмам для биосинтетических реакций необходимы соединения, содержащие фосфор, серу, а также ионы магния, калия, кальция, железа и другие микроэлементы.

Потребность того или иного микроорганизма в определенных факторах роста является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или иных аминокислотах (одной или нескольких), поскольку не могут их самостоятельно синтезировать: клостридии нуждаются в лейцине, тирозине; стрептококки – в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем или иным аминокислотам, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов – жирные кислоты, необходимы для роста некоторых стрептококков и микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим стеринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы B, входят в состав коферментов и или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав NAD и NADF, стафилококки и бруцеллы – в тиамине (B₁), входящем в состав пирофосфата. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы – компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку путем пассивной диффузии, облегченной диффузии, активного транспорта и при участии фосфотрансферазной системы (рис. 12). Два первых пути не требуют энергетических затрат. Облегченная диффузия протекает при участии ферментоподобных белков — пермеаз. Этими путями в клетку переносится ограниченное количество соединений. Большинство метаболитов, ионов и других веществ транспортируется в клетку активным путем с помощью специфических пермеаз, локализованных в цитоплазматической мембране. Данный процесс требует энергетических затрат и происходит даже в тех случаях, когда концентрация упомянутых соединений в среде ниже, чем в микробной клетке. При этом каждая пермеаза переносит в клетку только определенную аминокислоту или другое соединение. Фосфотрансферазная система состоит из ферментов I и Hpr, а также набора субстратов, осуществляющих фосфорилирование.

Рис. 12. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку:

Различная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия. S – высокая, а s – низкая концентрация растворенных веществ; С – пермеазы; R – белок Hpr; R-ф – фосфо-Hpr; S-ф – фосфатная группа (по: Стейнер Р., 1979)

В процессе переноса может произойти химическая модификация вещества, например фосфорилирование углеводов при участии соответствующих ферментов.

Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты (энзимы). Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и является достаточно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами бактерий, широко применяется для их идентификации. Вместе с тем многие ферменты (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.