Большинство стадий глюконеогенеза представляют собой обратимые реакции, осуществляющие гликолиз. Только три реакции гликолиза необратимы, поэтому в процессе глюконеогенеза на трех этапах используются другие ферменты.
Важным моментом в регуляции глюконеогенеза является реакция, катализируемая фруктозо-1,6-бисфосфатазой – ферментом, который ингибируется АМФ. Противоположное действие АМФ оказывает на фосфофруктокиназу, т. е. для этого фермента он является аллостерическим активатором. При низкой концентрации АМФ и высоком уровне АТФ происходит стимуляция глюконеогенеза. Напротив, когда величина отношения АТФ/АМФ низка, в клетке наблюдается расщепление глюкозы.